A microscopia de expansão é uma técnica de imagem biológica que permite imagens em nanoescala usando um microscópio de fluorescência de difração limitada convencional. Ele funciona incorporando amostras em um hidrogel intumescível em água e, em seguida, expandindo o gel. Isso expande fisicamente as biomoléculas umas das outras, permitindo sua interrogação em uma resolução anteriormente alcançável apenas usando técnicas caras de imagem de alta resolução.
Os protocolos de microscopia de expansão atuais, no entanto, não são otimizados para adoção generalizada. As amostras devem ser tratadas com agentes de ancoragem personalizados para vincular biomoléculas e rótulos específicos ao hidrogel. Além disso, a maioria das abordagens alcançou apenas uma expansão de tecido de aproximadamente quatro vezes, restringindo a resolução efetiva para cerca de 70 nm em um microscópio óptico convencional com uma lente objetiva limitada por difração de 280 nm.
Para superar essas deficiências, uma equipe liderada pela Carnegie Mellon University desenvolveu uma nova estratégia de microscopia de expansão chamada Magnify. O protocolo, descrito em Biotecnologia Natural, usa um novo hidrogel mecanicamente robusto que retém um espectro de biomoléculas sem exigir uma etapa de ancoragem separada.
O Magnify pode expandir espécimes em até 11 vezes, permitindo imagens de células e tecidos com uma resolução efetiva de cerca de 25 nm usando um microscópio convencional. Quando combinado com imagem de flutuação óptica de super-resolução (SOFI, um método de pós-processamento computacional), alcançou uma resolução efetiva de cerca de 15 nm.
Os protocolos anteriores de microscopia de expansão também exigiam a eliminação de muitas biomoléculas que mantêm os tecidos unidos. “Para tornar as células realmente expansíveis, você precisa usar enzimas para digerir proteínas, então, no final, você tem um gel vazio com rótulos que indicam a localização da proteína de interesse”, explica o autor sênior Yongxin Zhao Em uma declaração de imprensa.
“Um dos principais pontos de venda do Magnify é a estratégia universal de manter as biomoléculas do tecido, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos, dentro da amostra expandida. As moléculas são mantidas intactas e vários tipos de biomoléculas podem ser rotulados em uma única amostra”, acrescenta Zhao.
Aplicações amplas
Zhao e seus colegas aplicaram o Magnify a uma ampla variedade de tipos de tecido. A imagem de uma seção do cérebro de camundongo expandida em 11 vezes corada para conteúdo total de proteína, por exemplo, permitiu a visualização da arquitetura nanoscópica de sinapses individuais no cérebro. O Magnify demonstrou um poder de resolução efetivo de cerca de 18 nm usando uma lente objetiva ×60 (limite de difração de cerca de 200 nm).
Os pesquisadores confirmaram a baixa distorção obtida pelo protocolo Magnify em vários tipos de tecidos, usando SOFI pré-expansão e microscopia confocal pós-expansão. Eles não encontraram alterações morfológicas substanciais entre imagens pré e pós-expansão de núcleos celulares e marcadores de proteínas em níveis macroscópicos ou de subdifração.
A equipe também testou o Magnify em uma variedade de espécimes fixados em formalina e embebidos em parafina – que estão entre as preparações de biópsia mais importantes, mas são difíceis de expandir com os protocolos atuais. Isso incluiu seções de tecido de rim, mama, cérebro e cólon e tumores correspondentes. O Magnify pode expandir as amostras em fatores de cerca de 8.00 a 10.77 em água, dependendo do tipo de tecido.
Um dos principais objetivos era tornar o Magnify adequado para uma ampla gama de espécimes de tecido, facilitando sua aceitação por pesquisadores que buscam adotar o novo protocolo. “Ele funciona com diferentes tipos de tecidos, métodos de fixação e até mesmo tecidos que foram preservados e armazenados”, diz o co-primeiro autor Brendan Gallagher. “É muito flexível, pois você não precisa necessariamente redesenhar completamente os experimentos com o Magnify em mente; funcionará com o que você já tem.
Aumentando a resolução
Para demonstrar o aumento adicional na resolução efetiva possibilitado pelo emparelhamento do Magnify com o SOFI, os pesquisadores usaram a combinação para obter imagens de organoides pulmonares humanos, em particular, os cílios que funcionam para limpar o muco nas vias aéreas. Com 200 nm de diâmetro e apenas alguns micrômetros de comprimento, essas estruturas geralmente são muito pequenas para serem vistas sem o uso de tecnologias como a microscopia eletrônica (EM).
Magnify-SOFI pode resolver completamente a estrutura oca dos cílios e corpos basais, incluindo o anel externo previamente mostrado por EM para compreender nove feixes de microtúbulos. Os pesquisadores estimaram a resolução efetiva em torno de 14–17 nm (usando uma lente objetiva limitada por difração de 280 nm). Eles também foram capazes de visualizar defeitos em cílios em células pulmonares com mutações genéticas.
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“Com as técnicas mais recentes do Magnify, podemos expandir esses tecidos pulmonares e começar a ver alguma ultraestrutura dos cílios móveis, mesmo com um microscópio comum, e isso agilizará as investigações básicas e clínicas”, comenta o coautor Xi Ren.
Com base no desenvolvimento bem-sucedido do Magnify, a equipe agora o está usando para estudar amostras de tecidos ainda mais complexas. “Isso inclui explorar tecidos infectados, bem como espécimes maiores, como órgãos inteiros”, diz Zhao Mundo da física. “Além disso, estamos trabalhando para otimizar o Magnify para investigar amostras humanas patológicas e estudar mudanças em nanoescala no cérebro durante processos de aprendizado e doenças. Com esses avanços, novas descobertas podem ser esperadas neste campo de estudo altamente promissor”.
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- Fonte: https://physicsworld.com/a/expansion-microscopy-enables-nanoimaging-with-a-conventional-microscope/
